Proteolytische Spaltung von humanem EpCAM und deren Einfluss auf die Zelladhäsion

EpCAM ist ein Transmembranprotein und wird auf verschiedenen Tumorentitaten de novo oder stark uberexprimiert. Es wird durch eine regulatorische intramembrane Proteolyse (RIP) prozessiert. Dabei wird es zunachst extrazellular durch ADAM Proteasen bzw. durch die BACE1 Protease gespalten. Die erste Spaltung ist somit gleichzeitig der geschwindigkeitsbestimmende Schritt. Das dabei entstehende Produkt (CTF-EpCAM) wird durch die γ-Sekretase mit hoher Effizienz weiter prozessiert und fuhrt zur Freisetzung von Aβ-Fragmenten und intrazellularen Produkten (EpICD). EpICD vermittelt Proliferation durch Aktivierung von Zielgenen (Myc, FABP5). Um die extrazellularen Spaltsequenzen zu identifizieren, wurde ein EpCAM Konstrukt mit einem FLAG und TEV Epitop, welche sich 42 Aminosauren vor der Transmembrandomane befinden, generiert und in Karzinomzellen (HEK293, FaDu, HCT-8) stabil exprimiert. Nach Inkubation von den Karzinomzellen, mit dem EpCAM-TF Konstrukt wurden entstehende Spaltprodukte aus dem Zellkulturuberstand immunprazipiert und massenspektrometrisch analysiert. Bei dem Vergleich von massenspektrometrisch gemessenen und theoretisch berechneten Fragmenten, ergaben sich zwei ADAM- Schnittstellen (Aspartat243/Prolin244, Prolin244/Glycin245) und eine BACE1-Schnittstelle (Tyrosin250/Tyrosin251). Zur Identifizierung der transmembranen Schnittstellen wurde ein Myc-CTF(EpCAM)- FLAG-TEV-YFP Konstrukt in Karzinomzellen (HEK293, FaDu, HCT-8) stabil exprimiert. Die Analyse der Schnittstellen erfolgte auf ahnliche Weise, wie bei den extrazellularen Schnittstellen. Funf Schnittstellen konnten auf diese Weise identifiziert werden, wobei der γ-Schnitt zu den Schnittstellen Valin273/Valin274, Valin274/ Valin275, Valin275/ Valin276 fuhrte und der e-Schnitt zu den Schnittstellen Valin284/Valin285 und Valin285/Leucin286 fuhrte. EpCAM wurde zudem als Zelladhasions-regulierendes Protein beschrieben. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit, war es den Einfluss der regulativen intramembranen Proteolyse EpCAMs auf die Zelladhasion zu untersuchen. Die Inhibierung der Spaltung durch α-, β- und γ-Sekretasen hatte keinen Effekt auf die Zell-Zell-Adhasion, sowie auf die Zell-Matrix-Adhasion. Auch ein zellularer Knockout hEpCAMs mittels CRISPR-Cas9 Tech- nologie in HCT-8 Zellen hatte im Vergleich mit EpCAM-positiven HCT-8 WT Zellen keinen signifikanten Einfluss auf die Zelladhasion. Um zellunabhangig das Adhasionspotential von EpCAM zu bestimmen wurde die direkte Protein-Protein Interaktion von rekombinaten hergestellten extrazellularen EpCAM (EpEx) mittels atomic force microscopy (AFM) bestimmt. Dafur wurde zunachst ein rekombinantes hEpEx-Fc Protein aufgereinigt. Es wurde die Protein-Protein Interaktion von EpCAM bestimmt und mit den Werten von BSA (negativ Kontrolle) und dem Zelladhasionsmolekul Desmoglein3 (positiv Kontrolle) verglichen. Es ergab sich kein signifikanter Unterschied zur negativ Kontrolle BSA. Die Untersuchung der Zelladhasion EpCAMs auf zellularer Basis und mittels AFM zeigte in den hier aufgefuhrten Experimenten keinen signifikanten direkten Einfluss auf die Zelladhasion. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit die proteolytische Spaltung EpCAMs auf Ebene der Aminosauren charakterisiert werden. Zudem wurde gezeigt, dass die Funktion EpCAMs, im Rahmen der hier durchgefuhrten Experimente, keinen direkten Einfluss auf die Zelladhasion hat.