Regulation of inflammatory responses by mRNA decay

TTP ist ein mRNS-destabilisierendes Protein, welches in Zusammenarbeit mit anderen Faktoren den Abbau von Entzundungsmediatoren, ausgehend von der Binding zur Ziel-3´UTR, hervorruft. Die Regulierung von TTP´s mRNS-destabilisierender Aktivitat ist komplex und involviert verschiedenste Aspekte wie Expression, zellulare Lokalisation, posttranslationale Modifizierungen und Interaktion mit anderen trans-agierenden Faktoren, welche cis-regulatorische Elemente binden. Interessanterweise konnen TTP und das mRNS-stabilisierende Protein HuR ein uberlappendes Repertoire an mRNS-Zielen wahrend einer Entzundungsreaktion binden, darunter wichtige pro-inflammatorische Zytokine (Tnf, Cxcl1, Cxcl2, etc.). Daher wollten wir einen tieferen Einblick in die kooperative Wechselwirkung von TTP mit anderen trans-agierenden Faktoren und deren Einfluss auf die Entzundungsreaktion gewinnen. Durch Immunoprazipitation konnte gezeigt werden, dass TTP mit HuR mittels Ziel-RNS interagiert; eine Interaktion zwischen TTP und Ago2 konnte allerdings nicht festgestellt werden. Daruber hinaus konnte nach der Etablierung eines sequentiellen RNS-IP-Protokolls gezeigt werden, dass mehrere mRNS-Sequenzen (z.B. Tnf, Cxcl2) simultan von TTP und HuR gebunden werden. Die funktionalen Konsequenzen des gleichzeitigen Bindens an mRNS wurde mittels CRISPR/Cas-9 Genom-editierten RAW 264.7 Makrophagen, welche Inaktivierung von TTP, HuR oder beider Gene fur TTP und HuR aufweisen, untersucht. Im Allgemeinen hat HuR einen geringen Einfluss auf die mRNS-Stabilitat von inflammatorischen Mediatoren und nur Tnf mRNS konnte als eindeutiges Ziel, reguliert durch direkte Konkurrenz zwischen TTP und HuR, identifiziert werden. Weiters wurden RAW 264.7 Makrophagen, welche markiertes TTP vom endogenen Lokus exprimieren, gewonnen. Da TTP in diesen Zellen inharent exprimiert wird erlaubt dieses System verschiedene Interaktions-Analysen, ohne die Risiken Artefakt-anfalliger Uberexpression berucksichtigen zu mussen.